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构建无需限制性内切酶和连接酶的cDNA文库——得到前所未有的克隆

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作者：未知文章来源：本站原创点击数：更新时间：2006-10-25 12:29:25

CloneMiner™ cDNA文库构建试剂盒(CloneMiner™ cDNA Library Construction Kit)使你能够得到具有高度代表性cDNA 文库，而不需要用限制性内切酶来切断你宝贵的基因。现在你能从高质量的cDNA文库中分离完整的全长基因。

克服文库构建的缺陷
传统的cDNA文库构建途径有许多与生俱来的缺陷：1)cDNA合成不佳，2)连接效率低，3)
在限制性酶切过程中造成克隆缺口或者断裂。任何一种缺陷都有可能造成目的克隆的丢失，尤其对于低丰度的基因。如果你确实得到克隆，仍有可能被限制性内切酶消化或者在接下来的亚克隆步骤中丢失，这是由于连接反应的无效造成的。CloneMiner™ cDNA 文库构建试剂盒提供了一种全新的更加有效的构建文库的途径，而没有限制性内切酶克隆法的局限。

高质量cDNA文库的构建
新的CloneMiner™ 试剂盒利用两种先进的技术使你能够获得全长基因百分比高并且能够消除文库构建中限制性酶切引起的偏差。（图1）：
· SuperScript™ II逆转录技术从初始的mRNA材料中得到全长cDNA的百分比很高。SuperScript™ II逆转录酶（RT）的Rnase H活性低，能极大减少第一链合成时RNA的降解。
· GateWay®技术，一种已经深入了解的位点特异性重组系统，介导了文库的构建过程。这使得您的cDNA片段转入到GateWay®供载体以构建整个文库。然后就可以通过GateWay®技术将DNA重组到各种各样的表达载体上。反应保持了原有的方向和开放阅读框，所以不需要多余的重复验证。有效地避免了限制酶和连接酶的使用。您可以构建高质量的文库用于高效深入的分析。

图1 CloneMiner™ cDNA文库构建方法
	1. 起始mRNA 2. 退火的寡聚dT－attB2－Biotin 引物 3. 用SuperScript™ II逆转录酶合成第一链和第二链cDNA 4. 连接attB1接头

	5. 加上接头的cDNA和pDONR™222载体混合在BP Clonase™酶存在时构建入门文库

图例	6. 得到的入门克隆有attL位点；产生的副产物是自由的ccdB基因 7. 转化E.coli并选择抗卡那霉素的克隆

获得全长的完整的克隆
传统的克隆方法需要使用限制酶来改变您的cDNA末端，以适合克隆载体，这存在一种风险，即您的基因可能被同样的酶切成几段。通过使用GateWay®技术来替代限制酶，CloneMiner™试剂盒避免了这种风险。没有任何克隆暴露在限制酶中，所以提供了最佳的克隆代表性和100％的全长的完成cDNA（图2）

选择筛选方法
CloneMiner™ cDNA文库可以使用任何量的技术来筛选分离特定的DNA信息，包括传统的方法如探针筛选或PCR扩增。另外，整个文库都可以转到表达载体上以进行表达克隆和功能分析。因为CloneMiner™ cDNA文库构建试剂盒整合了GateWay技术，所以您可以迅速地切换到各种表达系统中去。

满足您所需
为了使您的文库构建更加方便，CloneMiner™ cDNA文库构建试剂盒包含了您需要的各种试剂（表1）。您不用再去查找其他试剂。您所需要准备的就是您的实验材料。

图2 CloneMiner™ 试剂盒获得完整的全长cDNA克隆的百分比最高

与传统的途径相比，CloneMiner™ 技术获得完整的全长cDNA的百分比最高。百分比的计算依据统计学的频率，假设一个酶切割1.5kb的插入片段。

超乎寻常的技术得到最高质量的文库
使用CloneMiner™ cDNA文库构建试剂盒，您可以以一种前所未有的方法检测到低丰度的和新的基因，要找到您的基因吗？请致电我们马上订购Invitrogen产品。

很容易转化到其它表达系统中
采用Gateway®技术，你能够很容易将目的基因转化到其它的系统中，包括哺乳动物，昆虫，酵母和大肠杆菌来进行进一步的研究－不需要进行亚克隆（图3）。存在于每个Gateway®入门和目的载体上att位点之间简单的重组反应使你能够广泛选择各种表达系统。如需进一步了解Gateway®技术，请参考我们的技术文章——使用Gateway®技术进行克隆和表达，一切皆有可能

图3 Gateway®技术一览

1. 构建一个Gateway®入门文库
2. 与您选择的Gateway®目的载体混合